Terug naar de hoofdpagina uitwerkingen
Uitwerkingen les 10
Opgave specifieke acticiteit
Je hebt net een cupje van het enzym invertase gekocht. Het cupje bevat 5 mg eiwit. Je lost het cupje op in 1 ml buffer.
Invertase activiteit is te meten met een spectrofotometrische bepaling.
Je leest in een protocol:
Invertase activity can be measured indirectly using 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) reagent. This reagent reacts with reducing sugars to form 3-amino-5-nitrosalicylic acid, which strongly absorbs light at 540 nm. The absorbance at 540 nm was recorded for a 1 cm cuvet filled with the following solutions:
- 0,9 mL substrate solution in buffer
- 0.1 mL sample solution
Je meetresultaten uit het logboek:
In 10 minutes the absorbance was increased from 0.000 to 0.970 (increase was linear). The molar absorption coefficient of the product formed is 34000 M-1 * cm-1.
Calculate the specific activity of the enzyme in the protein sample. (U/mg protein sample)
Uitrekenen $\Delta n$
Wet van Lambert-Beer
$A = \epsilon \cdot c \cdot b$
of:
$c = \frac{A}{\epsilon * b}$
$c = \frac{0,970}{34000 * 1} = 2,85294\cdot10^{-05}\ mol/L$
$c = 2,85294\cdot10^{-08}\ mol/mL$ dus $\Delta n = 2,85294\cdot10^{-08}\ mol$
Specifieke activiteit
$specific\ activity = \frac{\frac{\Delta n (product formed)}{\Delta t}}{m(total protein in fraction)}$
$specific\ activity = \frac{\frac{2,85294\cdot10^{-08} mol}{10}}{5} = 5,70588\cdot10^{-10}\ mol/min/mg$
Er is nog een 10 maal verdunningsstap (100 ul in 1 ml)
$specific\ activity = 5,70588\cdot10^{-9}\ mol/min/mg$
1 unit is hoeveelheid enzym dat 1 micromol product omzet in 1 minuut dus:
$specific\ activity = 5,71\cdot10^{-3}\ \mu mol/min/mg$
$specific\ activity = 5,71\cdot10^{-3}\ units/mg$